Интересные статьи

УДК 632.938.1

Проблемы создания сортов сельскохозяйственных культур с длительной устойчивостью к болезням

О.С. АФАНАСЕНКО, руководитель лаборатории иммунитета растений к болезням ВИЗР, член-корреспондент РАСХН e-mail:olga.afanasenko@gmail.com

      К настоящему времени разработаны стратегии селекции основных сельскохозяйственных культур на устойчивость к наиболее вредоносным болезням, которые базируются на информации об эволюционном потенциале популяций возбудителей болезней и наличии генетического разнообразия устойчивости хозяев. В основу методологии создания устойчивых сортов положены принципы, как общие, применительно к любой сельскохозяйственной культуре (рис. 1), так и специфические, определяемые для каждой конкретной патосистемы.
      Последнее десятилетие характеризовалось бурным развитием методов молекулярной генетики, которые позволили картировать, клонировать и секвенировать некоторые гены устойчивости растений к болезням и гены авирулентности патогенов. Эти исследования показали значительную генетическую вариабельность, выражающуюся в кластеризации генов, множественном аллелизме и полимерии (аддитивных генов) генов устойчивости и позволили реализовать стратегию пирамидирования генов устойчивости. В то же время, несмотря на то, что на проблеме создания сортов с длительной устойчивостью сфокусированы усилия специалистов уже более 60 лет, до настоящего времени нет однозначного объяснения этого явления. Известно, что некоторые гены обеспечивают длительную устойчивость против определенных патогенов (табл. 1).

      пирамидирования генов устойчивости. В то же время, несмотря на то, что на проблеме создания сортов с длительной устойчивостью сфокусированы усилия специалистов уже более 60 лет, до настоящего времени нет однозначного объяснения этого явления. Известно, что некоторые гены обеспечивают длительную устойчивость против определенных патогенов (табл. 1).тей создания сортов с долговременной устойчивостью является использование доноров неспецифической устойчивости и пирамидирование генов специфической устойчивости. Для некоторых фитопатогенов, например таких, как возбудитель фитофтороза картофеля, фомопсиса подсолнечника, фузариоза колоса, единственно возможным способом создания устойчивых сортов является вовлечение в селекцию доноров неспецифической устойчивости. Например, ежегодный мониторинг популяций возбудителя фитофтороза картофеля, проводимый М.В. Патрикеевой (ВИЗР), показал, что в последнее десятилетие преобладают сложновирулентные расы, а появление изолятов А2 типа совместимости значительно ускорило расообразовательный процесс за счет регулярной половой рекомбинации.



      В нашей лаборатории В.А. Колобаевым создана коллекция доноров горизонтальной устойчивости картофеля к фитофторозу, полученных путем конвергентных скрещиваний с использованием культурных и диких видов картофеля. Доноры отличаются не только высокой устойчивостью к фитофторозу, но и устойчивостью к другим болезням и удовлетворительной продуктивностью (табл. 2).
      Непременным условием реализации любой из известных стратегий продления жизни генов расоспецифической устойчивости является наличие генетического разнообразия устойчивости растений к болезням. Такие исследования в отношении устойчивости пшеницы и ячменя к гемибиотрофным патогенам в лаборатории иммунитета растений к болезням ВИЗР являются традиционными. Первым этапом является скрининг коллекций, который мы проводим как в лабораторных, так и в полевых условиях на искусственных инфекционных фонах. При этом пополнение наших коллекций мы осуществляем в рамках длительного и плодотворного сотрудничества с ВИР, а также с Федеральным центром по селекции культивируемых растений Германии, ИКАРДА (Сирия), Центром сельскохозяйственных исследований Финляндии, Институтом селекции зерновых культур (Кромержиж, Чехия), Миннесотским государственным университетом (США), Виннипегской исследовательской станцией зерновых культур (Канада), Нордическим генбанком.
      Благодаря такому сотрудничеству в нашей коллекции, например, имеется большинство известных в мире источников и доноров устойчивости ячменя к гемибиотрофным патогенам.



      Л.А. Михайловой и Н.М. Коваленко за последние несколько лет проведен скрининг более 3000 образцов пшеницы, включающих районированные в РФ озимые и яровые сорта, сорта мягкой и твердой пшеницы и образцы редких видов по устойчивости к желтой пятнистости. Показано, что наибольшей частотой встречаемости устойчивых форм характеризуются виды пшеницы, происходящие из закавказского центра первичного генетического разнообразия. Созданы банки источников устойчивости пшеницы к желтой, темно-бурой пятнистостям и корневой гнили. В результате многолетней работы по генетическому анализу признака устойчивости ячменя и пшеницы к болезням в лаборатории созданы коллекции доноров устойчивости этих культур (табл. 3).



      Важной проблемой остается выявление комбинаций генов устойчивости, которые бы обеспечили длительную защиту хозяина от болезни. Анализ данных изменчивости популяций возбудителя сетчатой пятнистости ячменя за последние 9 лет показал, что в природных популяциях патогена существуют запретные комбинации генов вирулентности. Из 186 сравниваемых пар сортов отсутствие вирулентных изолятов к обоим сортам одновременно отмечено в 38 случаях, при этом выборка изучаемых изолятов к каждой сравниваемой паре колебалась от 150 до 1577. На рис. 2 приведены данные по редкой встречаемости изолятов, вирулентных одновременно к двум образцам, носителям частично эффективных генов устойчивости. Объединение в одном генотипе таких генов устойчивости нецелесообразно, так как в популяциях паразита уже существуют изоляты с комплементарными генами вирулентности. На рис. 3 показаны комбинации генов устойчивости, к которым отсутствуют соответствующие комбинации генов вирулентности у изолятов из природных популяций возбудителя. По-видимому, выявленные комбинации генов устойчивости могут обеспечить длительную защиту от болезни.



      Kota и международный коллектив из 18 авторов [6], в числе прочих стратегий использования генов устойчивости пшеницы к ржавчинным болезням, и в том числе к новой агрессивной угандийской расе возбудителя стеблевой ржавчины, создали методами генной инженерии кассеты из нескольких клонированных генов устойчивости (рис. 4). Такая конструкция имеется, но сами авторы задаются вопросом, будет ли она работать?
      Очень важным моментом при создании конвергентных сортов является наличие эффективных методов отбора в гибридных популяциях растений не только по фенотипу, но и по генотипу. Данную проблему в настоящее время можно решить путем использования молекулярных маркеров (ММ), которые позволяют ускорить процесс селекции и снизить затраты на многолетние испытания. В последние несколько лет исследования по выявлению ММ определенных генов устойчивости различных видов растений и, в частности злаков, интенсивно развиваются в основном в США, Австралии и некоторых странах Европы. Наибольший прогресс достигнут в разработке ММ для генов устойчивости пшеницы к ржавчинным грибам. Достаточно сказать, что только для возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы и ячменя выявлено более 60 ММ, которые ассоциированы с 34 генами устойчивости. Исследования по использованию уже разработанных ММ для выявления генетического разнообразия устойчивости пшеницы к бурой ржавчине успешно проводят в ВИЗР, ВИР, НИИСХЦРНЗ, Институте цитологии и генетики СО РАН.



      Для развития ДНК-технологий в России необходимо картировать известные эффективные гены устойчивости сельскохозяйственных культур для последующего использования их в селекции. Совместно с финскими коллегами нам удалось картировать гены, детерминирующие устойчивость к возбудителю сетчатой пятнистости у эфиопского образца ячменя СI 9819. Анализ дигаплоидов с использованием 6 типов ДНК-маркеров позволил выявить один доминантный ген, эффективный против восьми изолятов гриба различного происхождения (из США, Великобритании, Финляндии и Канады), в хромосоме 6Н, и гены, эффективные против отдельных изолятов, распределенные по всему геному (на хромосомах 1Н, 2Н, 3Н, 5Н и 7Н) [7]. Эти результаты вскрыли еще один пласт проблем, связанных с природой неспецифической устойчивости, которая может быть детерминирована генами специфической устойчивости, частично потерявшими свою эффективность.



      Мы продолжаем эту работу с целью картирования всех эффективных генов устойчивости ячменя к возбудителям сетчатой, темно-бурой пятнистостей и ринхоспориозу. Материалом для картирования генов устойчивости являются дигаплоидные линии (ДЛ), которые позволяют создавать пулы устойчивых и восприимчивых растений с одинаковым генотипом, то есть, различающиеся только по аллелям устойчивости. Важным преимуществом ДЛ по сравнению с F2 и F3 гибридами является возможность проведения неограниченного числа повторений при оценках устойчивости как к разным изолятам одного паразита, так и к разным возбудителям.



      А.В. Анисимовой, Н.М. Лашиной и М.А. Кузоватовой с использованием гибридов F1 от скрещиваний устойчивых и восприимчивых к болезням образцов ячменя на модифицированной среде Мурасиге и Скуга была инициирована культура пыльников и получены дигаплоидные растения-регенеранты (рис. 5, 6, 7). Определена эффективность регенерации в культуре пыльников ячменя для 19 комбинаций скрещиваний (рис. 8). Высокие показатели признака отмечены в комбинациях к-30453 ? к-27737, Пиркка ? к-23874, Harrington ? Harbin, Harrington ? к-25282. Созданы 6 дигаплоидных популяций, количество растений в которых достаточно для проведения молекулярного картирования генов устойчивости, по некоторым комбинациям сразу к 2-м и 3-м болезням (табл. 4). На сегодняшний день усилиями Е.К. Потокиной и А.В. Козьякова в сотрудничестве с Шотландским институтом сельского хозяйства (Scottish Crop Research Institute) осуществлено генотипирование двух популяций дигаплоидов с привлечением новейших SNP маркеров (Single Nucleotide Polymorphism), созданных для ячменя на базе технологических разработок компании «Illumina», то есть проведен анализ ДНК 176 дигаплоидных линий по полиморфизму 384 SNP с известными позициями на генетической карте ячменя и равномерно распределенных по геному. Полученные результаты позволяют создать генетическую карту для дигаплоидных популяций, полученных от скрещивания к-30453 ? к-27737 и Пиркка ? к-23874. В данный момент мы сосредоточены на оценке устойчивости линий этих дигаплоидных популяций к возбудителям сетчатой и темно-бурой пятнистостей, после чего будут идентифицированы и картированы в хромосомах ячменя новые генетические локусы, детерминирующие устойчивость к этим возбудителям, а в перспективе и к ринхоспориозу, пыльной головне и мучнистой росе.



      На базе этих разработок, возможно, будут клонировать гены устойчивости ячменя к болезням, и изучать их функции.
      Другой известной стратегией продления жизни генов расоспецифической устойчивости является создание многолинейных сортов или использование смеси сортов. Пока система семеноводства России не позволяет ориентироваться на такой тип защиты. А вот использование мозаики сортов с различным уровнем устойчивости, основанное практически на том же принципе поддержания генетической разнородности посевов реализован в Краснодарском крае коллективом сотрудников КНИИСХ под руководством академика Л.А. Беспаловой. Им удалось при использовании мозаики из 24 сортов пшеницы с различным уровнем устойчивости к бурой ржавчине значительно снизить проявление заболевания.



      Изучение механизмов изменчивости популяций гемибиотрофных патогенов пшеницы и ячменя являются традиционным направлением исследований в нашей лаборатории. Изучение генетики признака вирулентности возбудителя сетчатой пятнистости ячменя к широкому набору доноров устойчивости позволило выявить более 30 генов авирулентности и доказать характер взаимоотношений в патосистеме по типу ген-на-ген [5].
      Н.В. Мироненко и др. [1] было показано, что одним из механизмов регуляции паразито-хозяинных отношений в данной патосистеме является супрессия генов авирулентности. Эти данные свидетельствуют, что образования новых агрессивных рас паразита могут быть связаны не только с мутациями генов авирулентности, а с мутацией, либо рекомбинацией генов супрессоров. Здесь целый пласт проблем, решение которых приведет нас к более полному пониманию механизмов изменчивости фитопатогенов.
      Для изучения природных популяций паразитов мы используем маркеры вирулентности к сортам-дифференциаторам и изогенным линиям, а также молекулярные маркеры. При этом нами созданы оригинальные наборы сортов-дифференциаторов, один из которых для анализа популяций возбудителя сетчатой пятнистости имеет международный статус [4] и работа с которым продолжается в направлении создания изогенных линий.



      Показана высокая гетерогенность признака вирулентности для таких патогенов, как возбудители сетчатой пятнистости, ринхоспориоза ячменя, желтой пятнистости пшеницы и красно-бурой пятнистости овса и сравнительно невысокое разнообразие признака широкоспециализированного вида C. sativus, вызывающего темно-бурую пятнистость и корневую гниль ячменя и пшеницы (табл. 5).
      Распределение популяций в пространстве, степень их изоляции имеют значение для выбора стратегии использования генов устойчивости в селекции.
      При исследовании географических популяций возбудителя рака картофеля Н.В. Мироненко с соавторами было установлено существование генетических различий популяций паразита из Беларуси, Украины, Ленинградской и Московской областей, при этом наибольшей агрессивностью отличалась популяция из Московской области [2].



      В результате многолетнего исследования географических популяций возбудителя сетчатой пятнистости ячменя были выявлены значительные различия в их структуре, что позволило сделать вывод об их мозаичном распределении [3]. Существенное влияние на формирование популяций этого патогена оказывает сортимент ячменя. Наименьшее сходство по числу общих фенотипов вирулентности имеют популяции из различных стран Европы по сравнению с популяциями из одной агроклиматической зоны России. Такие же результаты получены Н.В. Мироненко и при использовании ДНК-маркеров. В популяциях Ленинградской области и Финляндии не выявлено ни одного общего генотипа. Это связано с различным сортиментом ячменя, обусловленным особенностями местных селекционных программ.
      Л.А. Михайловой и И.Г. Тернюк показано, что микроэволюционные изменения в популяциях возбудителя желтой пятнистости пшеницы при заселении новых территорий происходят в направлении расширения генетического разнообразия и усиления вирулентности по сравнению с популяциями, обитающими на освоенных территориях.



      Полученные данные объясняют различную эффективность источников устойчивости в разных агроклиматических условиях.
      Таким образом, разработка методологии создания сортов зерновых культур с длительной устойчивостью к болезням напрямую зависит от знания эволюционного потенциала наиболее вредоносных видов и генетического разнообразия устойчивости. Усилия лаборатории иммунитета растений к болезням ВИЗР сосредоточены, с одной стороны, на решение фундаментальных проблем иммунитета: межорганизменной генетики патосистем, геномики и механизмах изменчивости популяций возбудителей болезней. С другой стороны, полезными для селекционной практики являются наши методические разработки, генетические коллекции доноров устойчивости, исходный материал для селекции в виде дигаплоидных и беккроссных линий, а также разрабатываемые ДНК-технологии, базирующиеся на использовании ММ.
      Исследования поддержаны грантами РФФИ 08-04-00447, 08-04-13612, 08-04-00303.
      ЛИТЕРАТУРА
      1. Мироненко Н.В., Афанасенко О.С., Филатова О.А., Копаньке Д. Генетический анализ вирулентности возбудителя сетчатой пятнистости ячменя гриба Pyrenophora teres / Методические основы селекции зерновых культур и картофеля на устойчивость к болезням. – С-Петербург, 2005, с. 41–54.
      2. Мироненко Н.В., Хютти А.В., Афанасенко О.С. Характеристика популяций Synchytrium endobioticum по вирулентности, агрессивности и ДНК-маркерам. Микол. и фитопатол. 2009, т. 43, вып. 5, с. 460–469.
      3. Afanasenko O. Investigations on populations of Pyrenophora teres f. teres, the cause of net blotch of barley// J. Russian Phytopathol. Soc. v. 2. 2001, p. 9–18.
      4. Afanasenko O., M. Jalli, H. Pinnschmidt, O. Filatova, G. Platz. Development of an international standard set of barley differential genotypes for Pyrenophora teres f. teres / Plant Pathology, 2009, v. 58. p. 665–676.
      5. Afanasenko O., Mironenko N., Filatova O., Kopaahnke D., Kramer I., Ordon F. Genetics of host-pathogen interactions in the Pyrenophora teres f. teres (net form) – barley (Hordeum vulgare) pathosystem // Eur. J. Plant Pathol., 2007, v. 117, p. 267–280.
      6. Kota R., Lagudah E.S. et al. Cloned rust resistance genes and gene based molecular markers in wheat: current status and future prospects. Technical Workshop. BGRI. Cd. Obregon, Sonora, Mexico, March 17–20, 2009, p. 30–32.
      7. Manninen O., Jalli M., Kalendar R., Afanasenko O., Robinson J. Mapping of major spottype and net$type net blotch resistance genes in the Ethiopian barley line CI 9819// Genome 2006, v. 49, p. 1564–1571.
      Natl. Acad. Sci. USA. 2000. vol. 97, p. 13500–13505.
      8. Vera Cruz C. M., Bai J., Ona I., Leung H., Nelson R. J., Mew T.W., Leach J. E. Predicting durability of a disease resistance gene based on an assessment of the fitness loss and epidemiological consequences of avirulence gene mutation // Proc Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, p. 13500–13505.

---